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增强型 ECL超敏发光液

简要描述:增强型 ECL超敏发光液能够被辣根过氧化物酶(HRP)催化发光。本试剂盒优化了底物组成,使用了新型高效增强剂,发光强度比传统 ECL显色液提高了30-100倍,并有效地降低了背景。试剂盒使用新的氧化剂代替不稳定的双氧水,提高了试剂盒的稳定性,室温可稳定放置1年。工作液被 HRP 催化后,发出特定波长荧光(400-450 nm),可对X光胶片曝光,也可直接使用荧光CCD扫描

  • 产品型号:PN3301
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2023-08-21
  • 访  问  量:566
品牌g-clone货号PN3301
供货周期现货主要用途科研
应用领域生物产业

增强型 ECL超敏发光液产品介绍:

ECL化学发光试剂盒能够被辣根过氧化物酶(HRP)催化发光。本试剂盒优化了底物组成,使用了新型高效增强剂,发光强度比传统 ECL显色液提高了30-100倍,并有效地降低了背景。试剂盒使用新的氧化剂代替不稳定的双氧水,提高了试剂盒的稳定性,室温可稳定放置1年。工作液被 HRP 催化后,发出特定波长荧光(400-450 nm),可对X光胶片曝光,也可直接使用荧光CCD扫描,主要应用于Western 检测以及化学发光免疫检测系统。

使用说明:

一、缓冲液的配置:

1、一抗工作浓度:0.2-1.0 µg/mL。

2、HRP 标记二抗工作浓度:10-500 ng/mL,根据二抗效价调整。

3、显色液的使用比例:A液: B液 = 1:1(现用现配);10 cm2转印膜使用1-2 mL工作液。

二、增强型 ECL超敏发光液操作步骤:

1、根据常规操作转印结束后,进行封闭、一抗孵育、二抗孵育以及必要的洗膜步骤,根据膜的大小,按每 250px2膜使用1-2mL工作液,按比例吸取等体积溶液A和溶液B混匀,配制成发光检测工作液。

2、用平头镊子将膜取出,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上,使其均匀覆盖,室温孵育 1-2 分钟,此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。

3、X 光胶片法

a)用平头镊子夹起转印膜,膜的下缘轻轻接触吸水纸,去除膜上多余的液体,留下少量工作液,不要让膜全干燥。膜的蛋白面朝上,包裹于洁净保鲜膜内。轻轻赶出其间的气泡用小块透明胶带粘住四角,固定在 X 光片暗盒内。

b)在暗室中取一张X光胶片置于包裹的膜上,合上暗盒,曝光30秒至1分钟。立即显影、定影,根据曝光强度,调整下一张X光胶片的曝光时间。如果背景过高,可以使用两张X光胶片同时压片。

4、荧光拍照法:

a)如果需要使用 CCD 拍照,可以将膜放置于工作液中,开机后按照使用说明,将转印膜取出,进行拍照。

b)可以根据背景情况,调整机器测量参数,提高信噪比。

5、管式化学发光法:

a)将ECL的化学发光检测波长可设定在 425nm 左右,可以选择单点测量,或者取多次平均值。

b)按照机器要求,将配制好的工作液加入到样品管中,间隔一定时间测量发光强度。

c)意ECL系统的发光到达峰值有一定延迟(30-300 秒),不同样本的测量时间间隔要固定。

d)HRP 催化ECL发光的体系还受到反应温度以及 pH 的强烈影响,所以工作试剂准备以及发光测量需要考虑到此类因素。

注意事项:

1、试剂盒溶液A为底物,保存于避光试剂瓶中,溶液B为氧化剂。通常取样顺序是先取底物 溶液A,换枪头后再取氧化剂溶液B。

2、本试剂盒较为稳定,室温(25℃)可以保存一年以上,长期不用建议保存在 2-8℃。

3、使用生物素-亲和素系统时,避免使用牛奶封闭,可能会造成背景过高。

4、金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点,避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子,可以使用平头塑料镊子。

5、sodium azide抑制 HRP 的催化能力,在缓冲液中尽量避免使用sodium azide作为防腐剂。

6、封闭、洗膜、孵育等步骤耗时较长,注意膜与塑料界面的摩擦不均匀可能造成部分位置条带消失,可以在保鲜膜中孵育以及封闭,洗膜的塑料盒底面不要有明显凸起,可以通过剪角的方法,区别转印膜有蛋白的一面。

7、不同转印膜对蛋白的吸附能力不同,硝酸纤维素较软,避免出现折痕。PVDF膜使用前需要使用甲醇水化均匀。

8、勿将多张膜置于同一个洗膜盒中洗膜,相互吸附以及摩擦可能造成很深的背景。

9、转印、封闭、孵育都要避免气泡。

A and Q

Q:胶片无条带显现或者信号较弱。

A1:转膜的效率低 --用预染色分子量标准来判断,提高转膜效率。

A2:抗原/抗体量少或不匹配 --增加抗原/抗体量或选择合适抗原/抗体。

A3:X光胶片有问题 --X光片洗片以后应当为透明的胶片,如果全黑则说明已经全曝光了,应当废弃。

A4:定显影液有问题 --可以先曝光一张胶片来验证,若有问题及时更换新的定显影液。

A5:反应系统中HRP量过多 --稀释HRP标记物。

Q:X光胶片背景脏。

A1:一抗、二抗浓度太高 --降低抗体浓度,延长封闭时间。

A2:抗体未清洗干净 --增加洗膜次数。

Q:条带有空斑。

A:抗原以及二抗的浓度过高 --稀释样品重新跑胶,也可以将混合好的显色液冰浴后,加入到膜上,立即快速显色。

Q:带型不规则。

A:转膜时有气泡也有可能是转印膜没有水化均匀 --转膜时尽量优化条件。


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